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纳米抗体开发时“草泥马”的选择

随着纳米抗体在抗体药与细胞治疗上的火热,很多伙伴都在从事纳米抗体研发相关工作,从文献中我们常见到三种动物即:骆驼(Camel),羊驼(Alpaca),美洲驼(llama),因此就有很多朋友纳闷三种动物我们应该如何选择呢?它们在抗体序列上有什么区别呢?本文给大家详细的介绍:


骆驼,羊驼,美洲驼都属于骆驼科,骆驼科Camelidae仅3属6种,分布于亚洲和非洲(骆驼族Camelini)以及南美洲(羊驼族Lamini),骆驼族是从北美洲进入亚洲和非洲的一支的后代,体型大,有驼峰,适应沙漠生活,现存有2~3种,即单峰驼Camelus dromedarius,双峰驼Camelus bactrianus和野骆驼Camelus ferus:单峰驼分布于中东和北非,驼峰1个,现存仅有家畜,野生的早已灭绝,但是有些再次被野化,如引入澳大利亚的单峰驼现在在澳洲沙漠中形成了一定规模的野生种群;双峰驼和野骆驼分别指家畜和野生的双峰驼,驼峰2个,分布于亚洲中部,后者驼峰较小,毛较短,四肢则较长,数量非常稀少。羊驼族是从北美洲进入南美洲的一支的后代,体型较小,无驼峰,分布于安第斯山区和南美洲南部的草原、半荒漠地区,其中家羊驼Lama glama和小羊驼Lama pacos为家畜,色系品种较丰富。


  • “草泥马”分类

“草泥马”至少在创建之初是只针对羊驼君的,但是其他几种美洲驼长相与羊驼君类似,所以不幸躺枪。这些躺枪的呆货们包括原驼、大羊驼和小羊驼。所谓美洲驼,指的是骆驼科三属六种中分布于美洲的两属四种,骆驼科的分类形式如下:


骆驼属(camelus)

双峰驼Camelus bactrianus

单峰驼Camelus dromedarius

羊驼属(Lama)

大羊驼(美洲驼)Lama glama=Llama

原驼Lama guanicoe

小羊驼属(Vicugna)

骆马Vicugna vicugna

羊驼(小羊驼)Vicugna pacos=Alpaca=Lama pacos


骆驼是最好区分的,羊驼与美洲驼最大的区别在于个体大小,羊驼一般成年提供能达到60Kg,而美洲驼可以达到约127-204千克, llama 腿毛比较少,耳朵呈香蕉形弯曲且比较大,脸上毛比较短。而alpaca腿毛比较厚实,耳朵直立比较大且短,脸上毛与身体一样比较厚。


640.jpg

640 (1).jpg

羊驼(Alapca)

美洲驼(llama)


  • “草泥马”体内单域抗体含量

三种动物中以骆驼体内单域抗体含量最高,约70%,而羊驼与美洲驼体内单域抗体的含量约25%~45%之间,我们可以从扩增VHH 片段的PCR的结果可以很明显的看到,也反应了骆驼可以更容易筛选到纳米抗体。


640 (2).jpg640 (3).jpg640 (4).jpg
CamelAlpacallama

以上数据来源于NBbiolab的Large VHH Naïve libraries数据


  • “草泥马”抗体分类

骆驼科体内既有常规抗体IgG1(两种重链,两条轻链),还有单域重链抗体,其结构只有重链且恒定区缺失CH1。

640 (5).jpg

根据铰链区的不同我们可以将骆驼科的抗体分为如下亚型:

640 (6).jpg

其中IgG2与IgG3 属于单域重链抗体,三种动物体内抗体亚型分别如下,

Alpaca:IgG1a,IgG1b,IgG2b,IgG2C

Llama:IgG1a,IgG1b,IgG2b,IgG2C

Camel:IgG1a,IgG1b,IgG2a,IgG2c,IgG3


  • 单域重链抗体Germline 数据

IMGT数据库我们可以知道

Camel

IGHV3S1 to IGHV3S41, is conventional tetrameric IgG1. IGHV3S42 to IGHV3S74, is single domain heavy chain antibody,共计33条

Alpaca

IGHV3-3 and IGHV3S53 to IGHV3S68 is single domain heavy chain antibody,共计,共计17条

Llama

IGHV3S1 to IGHV3S5 is single domain heavy chain antibody,共计5条

从Germline 数据我们可以知道Camel 抗体具有更高的多样性。


  • 特征氨基酸

传统抗体的FR2中,V42、G49,L50和W52这4个氨基酸残疾参与VL的相互作用,而VHH 这四个位置发生了突变,突变如下表:


Camel VHH FR2-amino acid positions

FR2-amino acid positions42495052
IGHV3S42 to IGHV3S74F,Y,A,N,GE,Q,G,L,T,AC,R,M,PF,G,L,W,Y,S,R,A,P,M,V


Alpaca VHH FR2-amino acid positions

FR2-amino acid positions42495052
IGHV3S42 to IGHV3S74F,Y,L,VE,Q,G,E,P,D,S,KR,Q,L,HF,G,L,W,M,Q,Y


Llama FR2-amino acid positions

FR2-amino acid positions42495052
IGHV3S1 to IGHV3S5F,Y,W,M,V,LE,A,D,G,Q,VR,LG,F,L,W,A,V

以上数据统计来源于NBbiolab的Large VHH Naïve libraries NGS数据


  • 分子内二硫键位置与丰度

VHH除了正常的23位与104位形成二硫键外,常常在CDR1或FR2与CDR3之间形成额外的一对二硫键,这对二硫键起到稳定抗体结构的作用,虽然能够让抗体保持很好的稳定性,但是在工艺开上往往容易导致二硫键的错配,如果突变掉以后,抗体就丢失活性。查询Ablyx的专利,发现Ablyx公开的序列中未发现两对二硫键的序列。Camel,Alpaca,llama 在额外二硫键的位置与丰度上有很大的不同。

640 (7).jpg

Camel 前面已经介绍了血清单域抗体含量高,且抗体Germline更丰富,但是除了IGHV3S42以外,剩下32条都含有额外二硫键,其中IGHV3S43~ IGHV3S71 二硫键的位置在CDR1~CDR3,IGHV3S72~ IGHV3S474二硫键的位置在FR2的50位氨基酸~CDR3.采用NGS 分析NBbiolab的Phage & Yeast display based Naïve VHH libraries from Camelus bactrianus,发现85%以上的序列都含有两对二硫键。


Alpaca 17条Germline中,有8条含有两对二硫键,额外二硫键的位置在55位与CDR3之间,采用NGS 分析NBbiolab的Phage display based Naïve VHH libraries from Alpaca,发现32%的序列有两对二硫键。


Llama 5条Germline中,3条有两对二硫键,额外二硫键的位置在55位与CDR3之间,采用NGS 分析NBbiolab的Phage display based Naïve VHH libraries from llama,发现22.3%的序列有两对二硫键,与文献中报道的llama是这三个物种血清中二硫键最低的一致。


  • 纳米抗体与human VH同源性

Camel VHH与human VH同源性在67。5%~74。3%之间,而Alpaca,llama与human VH的同源性在80%~87。3%之间。


  • 纳米抗体分类

VHH 属于Ⅲ族家系3,其至少可以再细分为 4 个亚家系 VHH1~VHH4。通常,高变区主链经常呈现的构象称为规范结构(canonical structure),VHH 中 CDR1 与 CDR2 的主链规范结构与传统的明显不同;而且,不同的 VHH 亚家系有不同的 CDR1 和CDR2 规范结构。


VHH1 和 VHH2 的 CDR3 长度较短,没有超过传统 VH的 CDR3 平均长度,但仍然保持高度的可溶性、稳定性和结合抗原的功能性;只有VHH3 和 VHH4 的 CDR3较长,氨基酸残基数达到16~24个,远远超过传统VH的 7~9 个氨基酸残基的数量,形成的指状凸环能嵌入抗原分子沟槽或裂隙内,增大与抗原相互作用的面积。


VHH3主要存在于羊驼中,一般在FR2与CDR3有一对额外的二硫键;;VHH4主要存在于骆驼中,在CDR1与CDR3之间形成一对额外的二硫键(85%)且11位的亮氨酸(L)变为了丝氨酸(S)。


VHH各亚家系中FR1和FR3的氨基酸序列彼此同源,且均与人或小鼠VH Ⅲ族的家系3同源。


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